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操作液相的三个关键词都在这里......

发布日期:2020-07-31      浏览次数:1270

高效液相色谱仪(HPLC)现已成为有机化学分析的重要手段之一,已成为不可或缺的分析仪器。不管你买十几万还是几十万的液相,都与液相的操作有关,关于液相的操作注意事项,重要的有三点:脱气、过滤和冲洗。

脱  气

流动相使用前必须进行脱气处理 ,以除去其中溶解的气体(如O2),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度下降,甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法有如下几种:

1.吹氦脱气法:

利用液体中氦气的溶解度比空气低的特性,采用一个高效分布式喷射流装置,一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好,但我们国内氦气价格较高,很少有实验室采用此方法。

2.加热回流法:

此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率,否则溶剂会丢失混合流动相的比例会有变化。

3.抽真空脱气法:

此法可使用真空泵,降压至0.05~0.07MPa 即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化,从而影响到实验的重现性,因此多用于单溶剂体系的简单分析。

4.超声波脱气法:

将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中,用超声波震荡10~20min。此法的脱气效果差。

5.在线脱气法:

现在商品的HPLC 仪器,均可配在线脱气机。在线脱气使用简单,低故障,有效。建议购买仪器时一定要购买,有的公司是作为选购件,所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。

过  滤

任何颗粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住,所造成的结果是将柱子堵塞,表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此,要采取各种预防措施,包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计,努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中,从而延长仪器和色谱柱的使用寿命,并提高数据的可靠性。在HPLC系统中,颗粒物的主要来源有三个途径:流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。

1.流动相

如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成,流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级的有机溶剂,例如乙腈、甲醇等,在制造的工艺过程中都已经过了0.2μm微孔滤膜过滤。然而,如果有任何一种缓冲液中加入了固体物,例如,磷酸盐,流动相过滤将是必要的一个步骤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的,但它还是可能含有颗粒物质。因此,流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤,反之所有流动相组成在使用前必须过滤。

2.被测样品

液相系统中的第二个颗粒物来源是被测样品。你使用了针筒式过滤器就不可能100%得到通过过滤器的被测样品,总会有或多或少的丢失。丢失来自这样几方面:过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。所以过滤这步已成为不可或缺的一步。在实际分析工作中,一般检测每一组样品会带一个外标、一个添加回收或是质控样品,所以,只要终检测时得到的信噪比能满足检出限要求,可将这步视为系统误差而忽略。

3.仪器系统部件的磨损物

后,在HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。一种建议认为建议半年或一年更换这些密封垫,实验室应基于上述观点制定定期预防性维护计划。另一种建议则认为,只要不漏液就不要轻易更换密封垫。两种说法都有其道理,具体如何操作,建议与仪器公司工程师沟通,各公司的仪器还是有些不同的。

冲  洗

使HPLC系统良好运行的第三个要点是保持系统的清洁。你需要关注流动相流经该系统的所有地方,对于这些地方经常性的冲洗,将使你的系统保持在“Ready”状态:

1.流动相储液瓶

首先要经常清洗流动相储液瓶,或者每做一批新样品更换一次流动相。一个脏的储液瓶将会污染注入的流动相。建议储液瓶中缓冲液使用时间不要超过一周,而有机溶剂使用时间不要超过一个月。仪器公司的工程师建议储水瓶的水要天天换,每周瓶子还应该用异丙醇清洗一次。有的实验室则在水里加入0.1~1 mM的甲酸抑制微生物的生长。

2.泵

接下来要冲洗的是泵。千万不要一分析完冲几分钟后就停泵,特别是当流动相中含有难挥发的缓冲液(如磷酸盐)时。如果仪器不是连续使用,当流动相蒸发时,难挥发物就会粘在活塞密封垫的表面,难挥发物将形成固形物沉淀。这是泵密封垫磨损和单向阀渗漏的主要原因之一。所以,无论使用长短,在停泵以前一定要用非缓冲液流动相冲洗泵在半个小时以上,要是流动相中有难挥发缓冲盐则建议冲洗的时间应该更长些。

3.自动进样器

自动进样器也要按规定清洗。现在的仪器多配有自动进样器的冲洗液瓶,通常只要注意及时更换、补充冲洗液即可。自动进样器用的洗涤液也要采用与流动相相同的方式处理,并根据溶剂的有效期和规定,清洗储液瓶或更换洗涤液。现在的自动进样器设置、操作都很简单,如果时间允许(特别是利用夜间运行),每次分析完后设置进1、2针纯溶剂(如甲醇、乙腈),也是一个好做法。

4.色谱柱

对柱子的污染是随使用时间而增加。通常表现是:运行走基线时在记录的色谱图中基线噪音增加,泵压也增加。解决这个问题的有效方法就是在每一批样品分析结束后或准备卸下柱子时用大量的流动相冲洗柱子(例如甲醇、乙腈和水)。用梯度冲洗效果更好,具体的比例要根据柱子的说明书和性质而定。

5.检测器

如果是正常使用,检测器将依据其性质并按照说明书规定进行洗。例如UV/VIS检测器或FL检测器,在对柱子和系统进行冲洗时也就一同对检测器流通池中污染物进行了清洗。但是蒸发光检测器或质谱仪则需要按照说明书进行定期清洗。因而,需要定期清洗。而且对连有这些检测器的系统冲洗时,要将与这些检测器断开,以减少对检测器的污染。

总之,实验室日常使用的液相色谱仪要是能认真做好这三项工作——脱气、过滤和冲洗,你的仪器可以得到良好的预防性维护,使用时就会感到比较顺手。当然,在实际操作时遇到的问题并没有这么简单,但这三个良好习惯将是正确操作、使用HPLC系统的基础。

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